中药、天然药物局部刺激性和溶血性
指导原则编号：【Z】GPT4-1
中药、天然药物局部刺激性和溶血性
研究技术指导原则
（第二稿）
[概述]
一、定义和意义
中药、天然药物局部刺激性和溶血性是指中药、天然药物制剂（包括活性成分和赋形剂）经皮肤、粘膜、腔道、肌肉、血管等非口服途径给药，经渗透吸收或注射后对给药部位以及全身产生的毒性作用，包括血管、肌肉、粘膜等刺激性及血管外或血管内溶血或红细胞凝聚等反应。它是临床前安全性评价的组成部分。
中药、天然药物制剂，包括活性成分或组分、体内代谢物、赋形剂、有关杂质及制剂的理化性质（如pH、渗透压等）均是可能导致给药部位毒性产生或溶血性产生的因素，因此，为指导临床合理用药，为提示临床应用时可能出现的毒性反应和程度、安全剂量或浓度、安全范围、临床研究监测指标、解毒或解救措施等提供参考，故应进行中药、天然药物制剂局部应用的毒性试验。
二、背景和目的
安全、有效是临床用药的关键，传统观念认为中药作用缓和，用药安全。这一观念有很大局限性，随着医学尤其制药科技的飞速发展，对中药的研究逐渐深入，出现了越来越多的新剂型、新给药途径的中药制剂，其剂型和给药途径的改变，与传统中药多口服给药的用药特点有了较大的差异,这些必然引起药物体内过程的改变，带来一些传统中药制剂所未曾有的安全性方面的问题。因此，在发挥疗效的同时，也造成了临床应用中不良反应增多的现象。随着国家药品不良反应监测报告制度的建立和逐步完善，中药制剂，特别是中药注射剂临床不良反应的报告屡见不鲜。
此外，中药成分复杂，其有效成分、配伍后产生的新成分、体内代谢产物、制备过程中的杂质、辅料及制剂的理化性质等多种因素均可引起用药部位的毒性，而局部用药的安全性又直接影响到患者的依从性，甚至影响了临床疗效。因此，局部用药，包括皮肤、粘膜、腔道等，以及注射途径给予的中药新药的安全性日益受到重视，安全性评价也显得更为重要。
鉴于上述情况，本指导原则旨在阐明进行临床前局部给药的毒性研究的目的、意义和重要性，阐明进行中药新药安全性评价的基本原则、相关技术要求及该领域存在的问题，阐明应利用具体问题具体分析的方法，针对药物的自身特点，结合药学、药效学、其他毒理学及临床应用信息，通过合理、客观的试验设计和研究，探索、揭示或发现中药、天然药物局部给药的毒性反应，预测临床应用中可能存在的潜在毒性，指导临床用药。
三、适用范围
本技术指导原则适用于非口服给药途径的中药、天然药物，包括中药注射剂及局部用药制剂。主要内容包括局部给药的毒性研究和评价的基本原则、刺激性试验和溶血性试验的相关内容。
[基本内容]
局部给药的特殊毒性研究必须执行《药品非临床研究质量管理规范》（GLP）。
在进行试验设计中，应遵循随机、对照、重复的原则。
应在遵循安全性评价普遍规律的基础上，运用具体问题具体分析的方法，结合受试物的自身特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学及临床拟应用情况等信息，体现整体性、综合性的原则，在阐明其研究方法或手段科学、合理的前提下进行规范性试验，对试验结果应进行全面分析，对药物的安全性做出综合评价。
二、局部刺激性试验
（一）定义
刺激性是指非口服药物制剂给药后对给药部位产生的可逆性改变，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。局部刺激性试验是考察动物的血管、肌肉、皮肤、粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。
（二）试验中应考虑的共性问题
1、试验目的
客观评价药物可能存在的毒性。
2、受试物
受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。
3、对照药选择
可用溶媒和/或赋形剂和/或基质作为阴性对照，其溶媒和/或赋形剂应标明批号、规格、生产厂家。如需要可选择阳性对照品进行对照。因局部刺激性与受试物制剂密切相关，相同活性成分制剂不同的受试物局部刺激性可能明显不同，若出现毒性反应，应与已上市品种进行比较性研究，以保证药物临床应用的安全性。
4、动物种属选择
应选择与人类皮肤、粘膜反应比较相近的动物，常用的动物有家兔、豚鼠。动物种属的选择应依据要观察的指标和模型的合理性。通常一个试验类型选择一种动物进行评价。
5、剂量选择
可选择几种不同浓度的制剂进行试验，其中包括拟用于临床研究的浓度，为临床研究的安全性提供选择依据。可以通过改变给药频次进行剂量的调整。对于局部用膏状制剂，在给药面积不变的情况下，不应通过增加厚度来满足增加给药量的目的。
6、给药途径
一般应与临床用药途径一致，特殊情况应加以说明。
7、给药部位
应选择与临床应用相似的部位进行，同时考虑选择周围组织或可能暴露于受试药品的部位。试验部位一般应与拟订的治疗靶器官或靶部位相同（如皮肤给药选择皮肤，眼科给药选择眼睛），也可以与拟定的非治疗靶组织的部位（如透皮吸收涂剂、静脉给药品种）不同。设计剂量级别和给药频次时，应考虑选用动物模型给药部位的解剖和生理特点。应能保证受试物在给药部位的有效暴露时间，并提供所采用的处理方法。单次给药的刺激性试验可采用局部半封闭斑贴法，采用纱布做斑贴物，在无刺激作用的前提下，用半封闭敷料固定。
8、给药频率和时间的确定
动物的给药频率和时间应依据拟订临床应用的情况来决定，即根据受试物临床拟用药情况确定采用多次或单次给药。但一般给药时间不超过4周。
9、观察指标
9.1肉眼观察 应详细描述动物的一般状态、行为、体征、给药局部反应等。局部反应应以计分的方式表示，包括红斑、水肿、充血程度及范围等。
9.2组织病理学检查 必须重视给药局部的组织病理学检查，重视组织学病变部位选择和详细记录，总体评分，对结果应进行半定量的分析、判断，并提供相应的组织病理学照片。
9.3全身毒性观察 在进行局部毒性试验时也应观察药物在局部吸收后的全身反应。
9.4可逆性观察 若出现中、重度局部刺激性反应，应进行停药后恢复期的观察，以明确毒性反应的恢复情况。
10、试验报告
应尽可能全面，包括受试物名称、理化性状、pH值、配制方法、给药量，动物性别、数量及体重范围、品系和来源（注明合格证号和动物级别），应以列表的方式显示实验动物在每一观察点的刺激反应，对除刺激性以外的毒性结果也应具体描述，根据结果应得出具体结论。
11、其他
因刺激试验结果从动物外推到人的可靠性有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性的物质较人类敏感，若用其他品系动物进行试验也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。
（三）试验方法
可参照附录。
三、溶血性试验
（一）定义
溶血性试验是考察受试物是否具有溶血和红细胞凝聚等反应。
药物制剂引起的溶血反应又可分为免疫性溶血和非免疫性溶血两类。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为II型和III型过敏反应；非免疫性溶血是药物直接导致的溶血和红细胞凝聚等。
某些中药注射剂，由于含有溶血成分或物理、化学及生物等方面的原因，在直接注入血管后可产生溶血作用；也有些注射剂中因含有杂质等成分，注入局部会引起胀痛，注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能障碍等不良反应；另外，因中药制剂的成分复杂，也存在因免疫反应引起的免疫性溶血。因此，凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。
（二）试验中应考虑的问题
因造成溶血反应的机制复杂，目前尚无全面的临床前溶血试验方法。中药注射剂溶血性的测定,许多年来一直用常规的体外溶血试验试管观察法（见附录）。它是通过肉眼来观察判断溶血情况，其误差较大，又受到有色泽中药注射剂对结果判断的影响，且不能具体测出溶血红细胞的数量。
为了精确检查中药注射剂的溶血性,建议在常规方法的基础上,结合以下或其他方法进行试验，如分光光度法、体外红细胞计数法、体内红细胞计数及分析法。这些方法与常规法比较,尽管前两者的操作相对复杂,影响因素较多，但当采用常规法测定的结果有疑问或必要时,采用计数法和分光光度法作为一种辅助方法,可帮助更精确的判断注射剂的溶血性。
建议在进行长期毒性试验中，增加或兼顾溶血性指标的观察（如红细胞数量及网织红细胞数的变化、胆红素、尿蛋白、肾炎、脾脏淤血及骨髓象等）。在受试物出现体外溶血阳性结果的情况下，利用体内溶血性试验，不但可以判断是否存在药物诱发溶血性的可能，而且可以通过对其他指标的测定提供更多的信息，如网织红细胞是否增高、是否有血红蛋白尿、球形红细胞是否增多，以及骨髓检查是否有溶血性贫血现象等。
（三）试验方法
可参照附录。
四、数据分析及评价
（一）应详细论述试验方法，说明试验分组、试验步骤、给药剂量和次数、动物数等。应详细描述试验结果，如中毒表现、毒性反应持续时间、恢复情况及时间、死亡动物数及病理组织学检查结果，并提供病理组织学照片，以利于对结果的分析和判断。
（二）应根据试验结果，按评分方式对不同剂量（或浓度）下某种反应发生情况及严重程度进行表述，分析毒性反应的量效关系和可能的时效关系及其可逆性，判断数据变化是否与受试物有关，确定中毒剂量、安全剂量及安全范围等。分析试验结果时应注意将给药的机械效应或受试物纯粹的理化作用与其毒性或药效作用区别开，正确理解试验结果的意义。
（三）根据局部用药毒性产生部位的毒性反应、病理检查及全身毒性观察结果，判断毒性靶器官或毒性可能涉及的器官组织等。
（四）在溶血性试验中，若出现红细胞凝聚现象，应进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若体外出现可疑溶血现象，应采用其他方法进一步试验，以确定或排除受试物的溶血作用。
（五）重视组织病理学检查及结果的量化：特别应重视刺激性试验中局部组织的病理检查，其病理变化建议用半定量的方法。
（六）结合药效学及其他毒理学试验结果进行综合分析，整体评价。注意不能将动物试验结果不加分析就外推到人，也不能忽略甚至故意舍掉个别出现毒性反应的动物，应实事求是地反映受试物的毒性，根据试验结果获得受试物在临床应用的意义及注意事项等提示。
五、常见问题及处理
（一）中药局部给药制剂种类繁多，如贴膏剂（橡胶膏剂、巴布膏剂、贴剂）、膏药（黑膏药、白膏药）、凝胶剂、软膏剂（乳膏剂、糊剂）、露剂、搽剂、气雾剂或喷雾剂（呼吸道吸入，皮肤、粘膜或腔道给药）、洗剂（皮肤、腔道涂抹或冲洗剂）、涂膜剂、鼻用制剂（滴鼻剂、喷鼻剂、洗鼻剂、涂鼻膏剂、鼻用散剂）、眼用制剂（滴眼剂、眼膏剂、眼用散剂）等。在进行局部刺激性试验时，其给药浓度的保证、给药后在局部的有效停留时间的确定等问题是正确评价其安全性的重要条件。
（二）随着新技术的不断应用，中药外用制剂及注射剂中更多地加入了附加剂，如透皮促进剂、增溶剂、抗氧剂、乳化剂、助悬剂、pH值调节剂、渗透压调节剂等；此外，因制剂种类的不同，加入了不同的基质等。因此，在进行局部刺激性试验时，应尽量排除这些附加剂及基质对局部的影响作用，若发现这些附加剂或基质等本身就具有明显的局部刺激性，则应做进一步的研究，重新或合理选择附加剂，以使得中药制剂的局部用药安全性增加。另外，对含有毒性药材又加入了透皮促进剂的中药外用制剂，应更加关注其对局部及全身的毒性反应。
（三）中药注射剂的血管刺激性是直接影响到病人用药的依从性和治疗方案得以顺利进行的因素，因此血管刺激性评价对于指导临床用药有很高的价值。但临床前动物试验中单次或几次连续给药多不能表现出血管刺激性，而在临床应用时，有的药物单次给药虽无刺激性，但多次给药、且在一定浓度下则可出现明显的刺激性，提示药物浓度和给药次数均与药物的血管刺激性密切有关。因此，建议临床前安全性评价中关注受试物的浓度、给药次数的选择，以及受试物在局部血管内的停留时间等问题，以期能提高临床前动物安全性评价的敏感性，及与临床人用结果的相关性，为临床合理、正确的用药提供指导。
（四）根据临床前和临床研究的结果，发现目前临床前体外溶血试验绝大多数为阴性结果，但临床应用过程中却有许多阳性结果的相关报道，即存在临床前和临床试验结果不一致的问题。因此，建议临床前研究中，在利用常规方法的同时，结合其他的试验方法，特别是在长期毒性试验（静脉给药）中增加或关注相关指标的检查，以综合评价中药注射剂的溶血性，增加与临床人用结果相关性的认识。
（五）有些中药注射剂上市后的情况，同一厂家的同一药物，不同批号的产品，溶血度即有很大差异，分析原因可能与生产中注射液的杂质去除程度、加入的附加剂的量、某些中药在水中的溶解度较低,且不同产地、生长季节及品种含量差异较大等因素有关。因此，在进行临床前溶血性试验时，建议至少进行3批制剂样品的溶血性试验。
（六）进行分光光度法试验操作时，应注意离心的速度及温度对试验结果的影响。可能有些药物分子及附加剂在离心时与红细胞发生碰撞的力量较大,速度较快,易导致非药物溶血现象的出现。此外，不同的中药注射剂颜色及深浅不同,若其色泽对血红素的最大吸收有干扰,则应注意排除非药物因素的影响。
六、不同剂型的中药、天然药物试验项目的选择
（一）静脉注射剂：应进行血管刺激性试验、肌肉刺激性试验及溶血性试验。
（二）肌肉注射剂：应进行血管刺激性试验、肌肉刺激性试验、溶血性试验等。
（三）皮肤给药制剂：应进行皮肤刺激性试验，必要时应进行眼刺激性试验。
（四）滴鼻剂：应进行鼻粘膜刺激性试验。
（五）口腔用制剂：应进行口腔粘膜或鼻粘膜刺激性试验（如喷雾剂）。
（六）眼用制剂：应进行眼刺激性试验。
（七）直肠、阴道用制剂：应进行相关腔道粘膜刺激试验。
（八）根据药物的特殊性，可进行试验项目的调整。需考察免疫毒性（如超敏反应）的相关制剂，应参照中药、天然药物免疫毒性研究技术指导原则进行。
[参考文献]
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14.FDA;Guidance for Industry Bacterial Vaginosis — DevelopingAntimicrobial Drugs for Treatment.
[附录]
一、局部刺激性试验方法
（一）血管刺激性试验
试验动物首选家兔。设置生理盐水或溶媒作为阴性对照。取耳背血管，观察给药后不同时间注射局部血管及周围组织反应情况，如充血、水肿等。用药周期应根据药物拟用于临床的情况决定，多次给药一般不超过7天。给药后48-96小时应对动物和注射部位进行肉眼多次观察和显微镜检查，观察期结束时应对注射部位血管和周围组织进行组织病理学检查，并提供病理照片。
建议在犬静脉注射给药的长期毒性试验中同时观察受试物对犬的血管刺激性，进行肉眼观察和组织病理学检查，对试验结果进行详细报告，并提供相应组织病理照片。
（二）肌肉刺激性试验
试验动物首选家兔，也可选用大鼠。试验中设置生理盐水或赋形剂作为阴性对照。分别在其左右两侧股四头肌内以无菌操作法各注入一定量的受试物，观察给药后不同时间注射局部肌肉反应情况，如充血、红肿、变性、坏死等。注射后48小时处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应，按表1计算相应的反应级，并进行局部组织病理学检查，提供病理照片。
表1肌肉刺激反应分级标准
刺激反应 反应级
无明显变化 0
轻度充血，范围在0.5×1.0cm以下 1
中度充血，范围在0.5×1.0cm以上 2
重度充血，伴有肌肉变性 3
出现坏死。有褐色变性 4
出现广泛性坏死 5
根据上表计算出4块股四头肌反应级的总和。若各股四头肌反应级的最高与最低之差大于2时，应另取2只动物重新试验。
（三）皮肤刺激性试验
试验动物首选家兔，也可用豚鼠。应设置赋形剂对照组。该项试验应同时设立完整皮肤和破损皮肤刺激性试验，破损皮肤试验可用砂纸磨损，并作“井”字形切口（以渗血为度）后给药。宜在背部进行试验。背部皮肤脱毛后，涂敷受试物，观察给药后不同时间的局部皮肤反应情况，如红斑、水肿、脱屑、结痂、及其它损害等，是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或菲薄等情况，记录其发生时间及消退时间，并对其反应程度进行评价。药物每次贴附时间及是否采用包扎固定应根据药物拟用于临床的情况决定，但贴附时间至少4-6小时。多次给药应连续在同一部位给药，重复给药若出现严重不良反应，则可更换贴附部位，并继续观察。试验时间无严格限定，应依据给药后24、48和72小时观察到的变化来决定。如果变化一直持续，则需要在给药后连续观察更长时间。试验结束时，应做局部组织的组织病理学检查，并提供病理照片。
结果评价：（1）单次给药皮肤刺激性试验，计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值。将受试物皮肤反应积分的平均分值减去赋形剂皮肤反应积分的平均分值得到原发性刺激指数，按表3进行刺激强度评价。（2）多次给药皮肤刺激性试验，首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每只动物刺激积分均值累积刺激指数，按表3进行刺激强度评价。
表2.皮肤刺激反应评分标准
刺激反应 分值
（1）红斑
无红斑 0
轻度红斑（勉强可见） 1
中度红斑（明显可见） 2
重度红斑 3
紫红色红斑到轻度焦痂形成 4
（2）水肿
无水肿 0
轻度水肿（勉强可见） 1
中度水肿（明显隆起） 2
重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚） 3
严重水肿（皮肤隆起超过1mm，范围扩大） 5
最高总分值 8
表3.皮肤刺激强度评价标准
平均积分值 评价
0 - <0.5 无刺激性
0.5- <2 轻度刺激性
2.0- <6 中度刺激性
6.0- 8.0 强刺激性
（四）粘膜刺激试验
1、眼刺激性试验
眼刺激性试验可用来评价眼睛及其它粘膜用药的刺激性，试验类型和范围的设计取决于眼睛暴露受试品的情况。
通常选用家兔，单次或多次给药取决于受试物拟订的临床应用方法而定，应设置赋形剂对照组。试验中应以一只眼睛作为治疗给药，另一只眼作为对照。每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受试物，应保证滴入的药物与眼有良好的接触和接触时间。给药周期应根据拟临床用药情况决定，多次给药一般不超过4周。观察周期应能保证观察到可逆和不可逆反应。观察范围应包括眼周部位，以及眼睑、结膜、瞬膜、角膜和虹膜。给药后30、60、90、120min，24、48和72小时，用双眼放大镜、裂隙灯和活组织显微镜等装置观察角膜、虹膜、结膜等反应情况，并按表3记录反应分值。此外，应观察结膜有无充血、水肿、畏光和流泪等刺激反应，并评分。将每只动物的积分相加得总积分，再除以动物数，按表4判断其刺激程度。
表3 眼刺激反应评分标准
眼刺激反应 分值
Ⅰ：角膜
混浊（以最致密部位为准）（A）
无混浊 0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清 2
出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 3
角膜不透明，虹膜无法辨认 4
角膜受损范围（B）
<1/4 1
1/4~<1/2 2
1/2~<3/4 3
3/4~1 4
A×B×5 理论最大值80
Ⅱ：虹膜（A）
正常 0
皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应 1
出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种） 2
A×5 理论最大值20
Ⅲ：结膜
充血（指睑结膜和球结膜）（A）
血管正常 0
血管充血呈鲜红色 1
血管充血呈深红色，血管不易分辨 2
弥漫性充血呈紫红色 3
水肿（B）
无水肿 0
轻微水肿（含眼睑） 1
明显水肿伴部分眼睑外翻 2
水肿至眼睑近半闭合 3
水肿至眼睑超过半闭合 4
分泌物（C）
无分泌物 1
少量分泌物 2
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 3
分泌物使整个眼区潮湿或粘着 4
（A+B+C）×2 理论最大值20
角膜、虹膜和结膜反应累加积分=Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ=110（最大评分）
表4 眼刺激性反应分级标准
评分 刺激分级 Kay and Calanda评价
0-0.5 无刺激性 Nonirritating
0.5-2.5 轻度刺激性 Practically nonirritating
2.5-15 轻度刺激性 Minimally irritating
15-25 中度刺激性 Mildly irritating
25-50 中度刺激性 Moderately irritating
50-80 重度刺激性 Severely irritating
80-100 重度刺激性 Extremely irritating
100-110 重度刺激性 Maximally irritating
2、直肠刺激性试验
通常选用兔或狗。给药容积可参考拟订的人体治疗容积或不同动物种属最大的可给药量。给药频率根据临床应用情况而定，通常每天1-2次，至少7天，每次给药与粘膜接触至少2-4小时，必要时肛门可封闭一定时间。观察内容：包括肛门区域和肛门括约肌，给药后临床表现（如疼痛症状）和粪便（如血、粘液），给药后动物的死亡和尸检情况，局部组织有无充血、水肿等现象，并进行肛周粘膜的病理组织学检查等。
3、阴道刺激性试验
通常选用大鼠、兔或狗。给药容积可参考拟订的人体治疗容积或不同动物种属最大给药量。给药频率根据临床应用情况，通常每天1-2次，至少7天，每次给药与粘膜接触至少4小时。观察内容：包括阴道部位、临床表现（如疼痛症状）和阴道分泌物（如血、粘液）等，给药后动物死亡和尸检情况，局部组织有无充血、水肿等现象，并进行阴道腔和生殖系统病理组织学检查等。
4、滴鼻剂和吸入剂刺激性试验
可选用家兔、豚鼠或大鼠，将受试物滴入或喷雾于动物，使受试物与粘膜接触至少4小时，给药后观察动物全身状况（如呼吸、循环、中枢神经系统）及局部刺激症状（如哮喘、咳嗽、呕吐、窒息等症状）等变化。单次给药24小时后或多次给药停药后24小时处死动物，观察呼吸道局部（鼻、喉、气管、支气管）粘膜组织有无充血、红肿等现象，并进行病理组织学检查。
5、口腔用药、滴耳剂等刺激性试验
可参照上述试验，给药途径改为口腔给药或外耳道给药，观察对口腔和喉粘膜，以及对外耳道和鼓膜的影响。口腔用药建议用金黄仓鼠，观察受试物对颊粘膜的刺激性。
（五）光毒性试验
光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或全身接触或应用化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应。光毒性反应是光敏中最常见的一种副反应。具有剂量依赖性，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着。严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。一旦发生，反应十分迅速，一般在光照24小时左右或更短时间发生。
1、试验动物
健康300-500g白化或无毛豚鼠，至少14只，雌雄各半。
2、试验分组
将豚鼠按体重性别随机分为二组，即对照组4只，试验组10只，雌雄各半。对照组在给予受试物和阳性对照药后不接受光照，试验组则在给予受试物和阳性对照药后接受光照。
3、药物和给药剂量
阳性对照药可选用8-甲氧基补骨脂素；根据受试物的溶解性、试验所需浓度、理化特性和动物局部、全身的耐受性等确定给药剂量并说明理由。一般选用二种浓度，其中低浓度为临床用药浓度。
4、给药方法
将背部去毛区划分为四个部位，每个部位按0.025ml（g）/cm2给药。给药情况如下：
组别 部位 给药处理 光照射
对照组 1 溶剂或赋形剂 否
2 受试物浓度1 否
3 受试物浓度2 否
4 阳性对照 否
试验组 1 溶剂或赋形剂 是
2 受试物浓度1 是
3 受试物浓度2 是
4 阳性对照 是
给药后，立即将动物放到特制的制动器上以限制动物活动。在光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在60min左右为宜。给药后适当时间（一般0.5-4小时），用温水或无刺激性的适宜溶剂除去对照组动物受试部位残留的受试物或赋形剂，将动物放回笼子中。试验组动物受试部位残留的受试物或赋形剂在光照后被清除。
5、光照方法
应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。试验时将动物放在光照台上固定并遮盖头部后，用适宜的光源（如水冷式氙灯）照射适当长的时间。一般认为波长应在280-450nm的范围内，照射时间在0.5-2小时之间，照射强度应适当，并在照射前后分别测定光照强度。
6、检查项目
至少在试验开始前及结束时称量体重，于24、48小时观察皮肤反应情况并以照片记录及表示。按表7记录各时间皮肤反应分值。
表7 皮肤反应程度的评分标准
皮肤反应情况 分值
无红斑 0
轻度红斑 1
中度红斑 2
重度红斑（不伴或伴有水肿） 3
7、结果判断及评价
与对照组比较，如果对照组动物的分值均小于1，则试验组动物分值大于等于1即为阳性；如果对照组动物分值为1或更大，则试验组动物分值大于对照组最大者为阳性。进一步可计算阳性率。
三、溶血试验方法
（一）常规体外试管法（肉眼观察法）
通常选用兔、羊、犬或人的血制备红细胞悬液，受试物按不同剂量加入（见表5），用蒸馏水和生理盐水作为阳性和阴性对照，温育后观察溶血或凝集反应情况。在37℃条件下至少观察1小时，或2-3小时。如溶液呈透明红色，则表示有溶血；如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，则表示有红细胞聚集。
表5. 体外溶血试验
ml 试 管 编 号
1 2 3 4 5 6 7
2%红细胞混悬液 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
生理盐水 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
蒸馏水 2.5
受试物 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
结果观察：若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。若有红细胞凝聚现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴家2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
结果判断：当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可供注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内发生溶血和/或凝聚，则受试物不宜注射使用。
（二）改进的体外溶血性试验法（分光光度法）
根据红细胞破裂释放出来的血红素在可见光波长段具有最大吸收的原理，采用分光光度法测定中药注射剂的溶血程度，具有操作简便,稳定性好,能消除常规试管观察法带来的主观误差等缺点,对临床安全用药有重要指导意义。
（三）体外红细胞计数法
采用显微镜直接计数红细胞的量,计算溶血百分率。重复2-3次,求其均值。溶血度(%)=[(空白对照管红细胞数-试药管红细胞数)/空白对照管红细胞数]×100%。
（四）体内溶血试验法（红细胞计数法）
必要时，可用动物做体内试验或结合长期毒性试验进行。采用显微镜直接计数给药前和给药后红细胞的数量变化，计算出中药注射剂的溶血百分率。该方法能够较精确测定出任何浓度下溶解红细胞的具体数值。
[起草说明]
一、关于本指导原则的重要性和意义
有效和安全是临床用药的关键。由于目前对有毒中药、中药中有毒成分及其毒副反应的研究深度不够 ,缺乏评价中药毒性级别的客观实验数据，以及受到中药作用缓和特点的影响，导致对中药安全性的评价认识不足，而使得作为新药安全性评价重要内容之一的特殊毒性研究置于长期不被重视的地位。
通过分析多年来上市后中药新药的不良反应出现情况，显示出中药注射剂的以下特点：（1）多发性和普遍性：几乎所有的中药注射剂均出现过不良反应，且较口服制剂和外用药多、重。（2）不可预知性：因中药注射剂中成分复杂，引起不良反应的物质不确定，且临床前相关安全性评价不能提供更直接的有价值的信息。（3）批次之间的差异性：因工艺技术条件、药材质量、制剂质控水平的制约，使批与批之间的差异性增大。（4）发生的规律性：出现不良反应的中药制剂多为静脉滴注给药的给药途径，其发生时间以即刻为主。（6）品种差异性：复方制剂的不良反应多于单方制剂。（7）配伍禁忌性：与一些药物配伍或联合应用可引起明显的不良反应。因此，随着对中药制剂不良反应发生认识的不断加深，以及目前相关基础研究薄弱性的现状，更加深了对新剂型或新给药途径的中药新药的安全性评价重要性和必要性的认识，相应地制定临床前特殊毒性研究指导原则也势在必行。
因此，该指导原则旨在阐明进行临床前特殊毒性研究的目的、意义、重要性和必要性，以及如何通过更合理、客观的试验研究或手段发现或揭示新药的不良反应，指导临床安全用药，另一方面也通过建立这一技术交流的平台，使审评与研究二者之间形成互动，相互交流、相互促进，使研发者主动、积极地进行研究，以推动我国中药新药研究水平更上一个新的台阶。
二、关于局部刺激性试验给药剂量、停留时间等问题
因非肠道给药途径的药物，受制剂等诸多因素的限制，其给药量方面可能受到较大影响。如腔道给药（主要指阴道、直肠给药）受药物浓度、腔道容量和剂型大小（如栓剂）的限制，无法提高到相当临床量多少倍的高剂量；皮肤外用药因受脱毛面积、摊涂厚度和受试物浓度的限制，也无法按常规要求达到剂量设计要求；气雾剂受药物因素、喷雾次数及吸入动作的限制，均影响了达到高剂量的要求。上述情况应允许在药剂学可能的条件下，在给药途径及给药容量的最大允许限度内有选择相应的高剂量或相当于临床用量即可。对于特殊给药途径的试验，如皮肤、直肠、阴道、口腔等，应根据不同品种的特点，采取适当的方法来保证药物在局部的停留时间，以充分、客观地观察到药物对局部的刺激作用。
三、关于血管刺激性等试验的相关说明
鉴于动物的解剖与生理特点与人类的给药途径有较大的差异，如大鼠阴道与尿道合一，肠道排泄频繁，给药后药物存留时间很短。而且除眼粘膜，肌肉、皮肤刺激性可根据肉眼观察评分来定量判断刺激性轻重外，其他给药途径尚缺乏规范化的评价标准，因此其他给药途径的局部刺激试验，必要时应增加半定量规范化的刺激试验，如静脉注射剂除进行血管刺激性试验外，应同时进行肌肉刺激性试验，以全面评价静脉注射剂对血管粘膜、平滑肌和周围组织的刺激反应（见下一问题）。
另外，血管刺激性试验中应选择临床给药浓度以及适当增加浓度，或通过增加给药次数（如5次）的方法来实现对血管刺激性的评价。
四、静脉注射剂为何在进行血管刺激性试验的同时要求肌肉刺激性试验的问题
因血管刺激性试验方法尚不规范，且血管注射后药物在血管中的停留时间较短，有时不能真正反映出对血管的刺激作用，另外，临床应用时不敢绝对保证不会渗漏到血管外。而肌肉刺激性试验相对规范，药液在局部停留时间较长，对局部的刺激作用比血管性刺激试验更敏感，也可提供更多的相关信息。因此，建议静脉注射剂应同时进行血管刺激性试验和肌肉刺激性试验。
五、关于溶血性试验方法确定等问题
中药注射剂溶血性的测定,许多年来一直用常规的体外溶血试验试管观察法,是通过肉眼来观察判断溶血情况，主观误差较大，又受有色泽的中药注射剂特别是复方制剂或临床配伍用药后引起的pH、渗透压、变色、沉淀或浑浊等因素的影响，且不能具体测出溶血红细胞的数量，故建议研究中可采用其他方法（见附录），以提高方法的灵敏性，更合理地评价注射剂的溶血性等为目的。
六、关于对中药注射剂及滴眼剂的渗透压测定的问题
对于中药注射剂和滴眼剂的渗透压，2000年版中药药典要求尽可能与血液或泪液等渗，在临床上也需调节在人体可耐受的范围内，当渗透压超过耐受范围时，注射剂会引起机体红细胞变形甚至破裂溶血，或会对局部组织细胞产生刺激作用而引起疼痛，而眼用制剂会使眼内角膜失水或涨大而产生不适，因此有必要针对中药注射剂及滴眼剂的渗透压进行质量监控。特别是当试验中提高了药物浓度后，应通过制剂学方面保证相应的制剂的渗透压特性等。
七、关于局部毒性试验中必要时应进行全身毒性观察的问题
在进行局部毒性试验时也应观察药物在局部吸收后的全身反应。在下述情况下可不要求提供进一步的全身毒性研究：（1）已证明制剂的吸收非常少，对全身影响的可能性可排除；（2）制剂虽然被吸收，但其全身毒性已被充分研究过。
八、关于局部刺激性和溶血性试验方法问题
指导原则附录中提供的具体的方法学仅作为研究者的参考，不希望以做作业的方式仅针对提供的试验方法进行研究。鼓励研究者针对品种的具体情况和科研中的具体问题，选择合适的方法进行探索性的研究。
[著者]
《中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究的技术指导原则》课题研究组
